Головна Каталог товарів Новини Статті Контакти
Телефонуйте:
+38 044 562 74 64
+38 050 971 86 71
Імунохромотографічні швидкі тести ПРОФІТЕСТ. Тест системи, витратні матеріали, обладнання для ІФА, ПЛР лабораторій, та відділень трансфузіології.

Каталог товарів

 

Полімеразна ціпна реакція (ПЛР)

(ПЛР) - експериментальний метод молекулярної біології, що дозволяє домогтися значного збільшення малих концентрацій певних фрагментів нуклеїнової кислоти (ДНК) в біологічному матеріалі (пробі).

Крім ампліфікації ДНК, ПЛР дозволяє проводити безліч інших маніпуляцій з нуклеїновими кислотами (введення мутацій, зрощення фрагментів ДНК) і широко використовується в біологічної та медичної практиці, наприклад, для діагностики захворювань (спадкові, інфекційних), для встановлення батьківства, для клонування генів, виділення нових генів.
Історія - На початку 1970-х років норвезький учений Хьелль Клеппе з лабораторії нобелівського лауреата Хара Гобинды Хораны запропонував спосіб ампліфікації ДНК за допомогою пари коротких одноланцюгових молекул ДНК - синтетичних праймерів[1]. Однак у той час ця ідея залишилася нереалізованою. Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) була винайдена у 1983 році американським біохіміком Кері Муллисом. Його метою було створення методу, який би дозволив амплифицировать ДНК в ході багаторазових послідовних подвоєнь вихідної молекули ДНК за допомогою ферменту ДНК-полімерази. Перша публікація за методом ПЛР з'явилася в листопаді 1985 року в журналі Science[2]. Через 8 років після цього за винахід методу ПЛР К. Мулліс отримав Нобелівську премію[3].
На початку використання методу після кожного циклу нагрівання-охолодження доводилося додавати в реакційну суміш ДНК-полімеразу, так як вона инактивировалась при високій температурі, необхідної для розділення ланцюгів спіралі ДНК. Процедура проведення реакції була порівняно неефективною, вимагала багато часу і ферменту. У 1986 році метод полімеразної ланцюгової реакції було суттєво покращено. Було запропоновано використовувати ДНК-полімерази з термофільних бактерій[4]. Ці ферменти виявилися термостабільність і були здатні витримувати безліч циклів реакції. Їх використання дозволило спростити і автоматизувати проведення ПЛР. Одна з перших термостабільних ДНК-полимераз була виділена з бактерій Thermus aquaticus і названа Taq-полімеразою. Недолік цієї полімерази полягає в тому, що ймовірність помилкового внесення нуклеотиду у неї досить висока, так як у цього ферменту відсутні механізми виправлення помилок (3'→5' экзонуклеазная активність). Полімерази Pfu і Pwo, виділені з архей, володіють таким механізмом, їх використання значно зменшує число мутацій в ДНК, але швидкість їх роботи (процессивность) нижче, ніж у Taq. Зараз застосовують суміші Taq і Pfu, щоб домогтися одночасно високій швидкості полімеризації і високої точності копіювання.
У момент винаходу методу Кері Мулліс працював хіміком-синтетиком (він синтезував олигонуклеотиды, які застосовувалися тоді для виявлення точкових мутацій методом гібридизації з геномної ДНК) в компанії Цетус (Cetus Corporation), яка і запатентувала метод ПЛР. У 1992 році Цетус продала права на метод і патент на використання Taq-полімерази компанії Хофман-Ла Рош за 300 млн доларів. Однак виявилося, що Taq-полімераза була охарактеризована радянськими біохіміками А. Калединым, А. Слюсаренко та С.Городецким в 1980 році[5], а також за 4 роки до цієї радянської публікації, тобто в 1976 році, американськими біохіміками Alice Chien, David B.Edgar і John M. Trela.[6] У зв'язку з цим компанія Промега (Promega) намагалася в судовому порядку змусити Рош відмовитися від виключних прав на цей фермент[7]. Американський патент на метод ПЛР закінчився в березні 2005 р.
Проведення ПЛР - Метод заснований на багаторазовому виборчому копіюванні певної ділянки ДНК за допомогою ферментів в штучних умовах (in vitro). При цьому відбувається копіювання тільки тієї ділянки, яка задовольняє заданим умовам, і лише в тому випадку, якщо він присутній в досліджуваному зразку. На відміну від ампліфікації ДНК в живих організмах, (реплікації), за допомогою ПЛР амплифицируются відносно короткі ділянки ДНК. У звичайному ПЛР-процесі довжина копійованих ДНК-ділянок становить не більше 3000 пар основ (3 kbp[8]). З допомогою суміші різних полимераз, з використанням добавок і при певних умовах довжина ПЛР-фрагмента може досягати 20-40 тисяч пар нуклеотидів. Це все одно значно менше довжини хромосомної ДНК эукариотической клітини. Наприклад, геном людини складається приблизно з 3 млрд пар підстав[9].
Компоненти реакції - Для проведення ПЛР в найпростішому випадку потрібні наступні компоненти:
ДНК-матриця, що містить ту ділянку ДНК, який потрібно амплифицировать.
Два праймера, комплементарні протилежних кінцях різних ланцюгів необхідного фрагмента ДНК.Термостабильная ДНК-полімераза - фермент, який каталізує реакцію полімеризації ДНК. Полімераза для використання в ПЛР повинна зберігати активність при високій температурі тривалий час, тому використовують ферменти, виділені з термофилов - Thermus aquaticus (Taq-полімераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полімераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полімераза) та інші.
Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Іони Mg2+, необхідні для роботи полімерази.
Буферний розчин, що забезпечує необхідні умови реакції - рН, іонну силу розчину. Містить солі, бичачий сироватковий альбумін.
Щоб уникнути випаровування реакційної суміші, в пробірку додають высококипящее масло, наприклад, вазелінове. Якщо використовується ампліфікатор з подогревающейся кришкою, цього робити не потрібно.
Додавання пирофосфатазы може збільшити вихід ПЛР-реакції. Цей фермент каталізує гідроліз пірофосфату, побічного продукту приєднання нуклеотидтрифосфатов до зростаючої ланцюга ДНК, до ортофосфата. Пірофосфат може інгібувати ПЛР-реакції[10].
Праймери - Специфічність ПЛР заснована на утворення комплементарних комплексів між матрицею і праймерами, короткими синтетичними олигонуклеотидами довжиною 18-30 підстав. Кожен з праймерів комплементарен одного з ланцюгів двохланцюжкової матриці і обмежує початок і кінець ампліфікованого ділянки.
Після гібридизації матриці з праймером (відпал[11]), останній служить початком для ДНК-полімерази при синтезі комплементарної ланцюга матриці (див. нижче).
Найважливіша характеристика праймерів - температура плавлення (Tm) комплексу праймер-матриця.
Tm - температура, при якій половина ДНК-матриць утворює комплекс з олигонуклеотидным праймером. Узагальнена формула підрахунку Tm для короткого олигонуклеотида (і для довгих фрагментів ДНК), з урахуванням концентрації іонів K+ і DMSO:
T_m = 77.1+11.7\lg[K^+]+\frac{41(G+C)- 528}{L}-0.75[%DMSO],[12]
де L - кількість нуклеотидів в праймере, K+ - молярна концентрація іонів калію, G+C - сума всіх гуанинов і цитозинов.
У разі невірного вибору довжини і нуклеотидного складу праймера або температури відпалу можливе утворення частково комплементарних комплексів з іншими ділянками матричної ДНК, що може призвести до появи неспецифічних продуктів. Верхня межа температури плавлення обмежений оптимумом дії температури полімерази, активність якої падає при температурах вище 80 °C.
При виборі праймерів бажано дотримуватися наступних критеріїв:
GC-складу ~ 40-60 %;
близькі Tm праймерів (відмінності не більш, ніж на 5 °C);
відсутність неспецифічних вторинних структур - шпильок[13] і димерів[14];
бажано, щоб на 3’-кінці був гуанін або цитозин, оскільки вони утворюють три водневі зв'язки з молекулою матриці, роблячи гібридизацію більш стабільною.
Ампліфікатор - ПЛР проводять в амплификаторе - приладі, що забезпечує періодичне охолоджування і нагрівання пробірок, зазвичай з точністю не менше 0,1 °C. Сучасні амплификаторы дозволяють задавати складні програми, в тому числі з можливістю «гарячого старту», Touchdown ПЛР (див. нижче) і подальшого зберігання амплифицированных молекул при 4 °C. Для ПЛР в реальному часі випускають прилади, обладнані флуоресцентним детектором. Існують також прилади з автоматичним кришкою та відділенням для мікропланшет, що дозволяє вбудовувати їх в автоматизовані системи.
Хід реакції-Зазвичай при проведенні ПЛР виконується 20-35 циклів, кожен з яких складається з трьох стадій.
Денатурація-двох ланцюжкову ДНК-матрицю нагрівають до 94-96 °C (або до 98 °C, якщо використовується особливо термостабільна полімераза) на 0,5-2 хв, щоб ланцюга ДНК розійшлися. Ця стадія називається денатурацією, так як руйнуються водневі зв'язки між двома ланцюгами ДНК. Зазвичай, перед першим циклом проводять тривалий прогрів реакційної суміші протягом 2-5 хв для повної денатурації матриці і праймерів.
Відпал - коли ланцюга розійшлися, температуру знижують, щоб праймери могли зв'язатися з одноланцюговою матрицею. Ця стадія називається відпалом. Температура відпалу залежить від складу праймерів і звичайно вибирається рівною температурі плавлення праймерів. Неправильний вибір температури відпалу призводить або до гіршого зв'язування праймерів з матрицею (при завищеній температурі), або до зв'язування в неправильному місці і появи неспецифічних продуктів (при заниженій температурі). Час стадії відпалу - 30 сек, одночасно, за цей час полімераза вже встигає синтезувати кілька сотень нуклеотидів. Тому рекомендується підбирати праймери з температурою плавлення вище 60 °C і проводити відпал і элонгацию одночасно, при 60-72 °C.Елонгація - ДНК-полімераза повторює матричну ланцюг, використовуючи праймер в якості затравки. Це - стадія елонгації. Полімераза починає синтез другого ланцюга від 3'-кінця праймера, який зв'язався з матрицею, і рухається уздовж матриці, синтезуючи нову ланцюг в напрямку від 5' до 3' кінця. Температура елонгації залежить від полімерази. Часто використовувані Taq полімерази і Pfu найбільш активні при 72 °C. Час елонгації залежить як від типу ДНК-полімерази, так і від довжини ампліфікованого фрагмента. Зазвичай час елонгації приймають рівним одній хвилині на кожну тисячу пар підстав. Після завершення всіх циклів часто проводять додаткову стадію фінальної елонгації, щоб добудувати всі одноцепочечные фрагменти. Ця стадія триває 7-10 хв. Кількість специфічного продукту реакції (обмеженого праймерами) теоретично зростає пропорційно 2n - 2n, де n - число циклів реакції[15]. Насправді ефективність кожного циклу може бути менше 100 %, тому в дійсності P ~ (1+E)n, де P - кількість продукту, Е - середня ефективність циклу.
Кількість «довгих» копій ДНК теж зростає, але лінійно, тому в продуктах реакції домінує специфічний фрагмент.
Зростання необхідного продукту в геометричній прогресії обмежений кількістю реагентів, присутністю інгібіторів, утворенням побічних продуктів. На останніх циклах реакції зростання сповільнюється, це називають «ефектом плато».

 

Дата: 15.09.2013