Головна Каталог товарів Новини Статті Контакти
Телефонуйте:
+38 044 562 74 64
+38 050 971 86 71
Імунохромотографічні швидкі тести ПРОФІТЕСТ. Тест системи, витратні матеріали, обладнання для ІФА, ПЛР лабораторій, та відділень трансфузіології.

Каталог товарів

 

Перспективи імуноферментного аналізу в діагностиці інфекцій, що передаються статевим шляхом

Лабораторна діагностика урогенітальних інфекцій передбачає рішення наступних завдань: ~ виявлення мікроорганізму в урогенітальному тракті або підтвердження факту наявності інфекції в анамнезі; ~ оцінка життєздатності мікроорганізму та визначення стадії

В лабораторній практиці застосовують прямі і непрямі методи діагностики. До числа прямих методів, що використовуються для вивчення інфекцій урогенітального тракту, традиційно відносять культуральні/бактеріологічні, методи прямої імунофлюоресценції (ПІФ) і полімеразної ланцюгової реакції, що дозволяють виявити безпосередньо мікроорганізм, або його антигени, або його генетичний матеріал. Непрямими прийнято вважати методи діагностики, що дозволяють побічно судити про зустрічі організму людини з тим чи іншим мікроорганізмом. До числа непрямих відноситься серологічний метод (імуноферментний і імунохімічний аналіз), призначений для оцінки імунної відповіді організму пацієнта на антигени бактерій і вірусів.
Обидві групи методів мають ряд переваг і недоліків. І, як відомо, в клініко-лабораторній практиці завжди вітається комплексний підхід у вирішенні діагностичної задачі, а саме використання як мінімум двох методів оцінки інфікованості пацієнта.
Иммуноферментый аналіз (ІФА) може застосовуватися для часткового вирішення всіх перерахованих вище клінічних завдань. Для підтвердження факту наявності інфекції в анамнезі пацієнта традиційно використовуються тести для виявлення IgG-антитіл до антигенів того чи іншого мікроорганізму. Для оцінки стадії інфекційного захворювання в лабораторії оцінюють додатково антитіла IgA і IgM класів, які є маркерами гострої інфекції. Визначення титрів IgG та IgA (з інтервалом 2 тижні або 10 днів) проводять при динамічному спостереженні в процесі терапії. Діагностично значущим є 2-4-кратне зміна титру антитіл.
Тим не менш, незважаючи на таку затребуваність у клініко-лабораторній практиці, ІФА не може вважатись провідним методом діагностики інфекції і тим більше “золотим стандартом“. Як варіант лабораторної технології, він є лише додатковим, уточнюючим методом, і не тільки в силу своєї приналежності до групи непрямих методів.
Проблеми технології ІФА можна умовно розділити на внелабораторные і лабораторні. До перших відносять низьку імуногенність ряду мікроорганізмів. У клінічній практиці нерідко зустрічаються ситуації, коли імунна система слабо або з запізненням відповідає розвитком адекватної імунної відповіді на відповідні антигени мікроорганізму. Нерідкі випадки імуносупресії у обстежуваних пацієнтів, обумовлені цілим рядом причин. І в тому і в іншому випадках лікар клінічної практики може бути незадоволений результатами лабораторного аналізу, т. к. серологічний профіль інфекції дійсно може не відповідати реальній їм клінічній картині. У разі вивчення імунної відповіді на антигени умовно-патогенних мікроорганізмів, виявлення певного титру антитіл не завжди є діагностичним критерієм участі даного мікроорганізму в патогенезі розвитку інфекції. Слід враховувати і певні особливості вже розвиненого імунної відповіді, який для кожного мікроорганізму має свої особливі риси: етапність синтезу різних класів антитіл, тривалість циркуляції в крові, задіяність клітин пам'яті в підтримці імунної відповіді у часі і т. д.
Лабораторні проблеми технології ІФА обумовлені особливостями тест-систем, які використовуються для діагностики, їх конструкцією і складом реагентів. Присутня проблема специфічності тест-систем, пов'язана з циркуляцією ревматоїдного фактора у ряду пацієнтів і в тій чи іншій мірі вирішується виробником. На жаль, є обмежений спектр рекомбінантних білків, які можуть бути ефективно застосовані для створення високоспецифічних ІФА-наборів. На сьогоднішній день закладу кдл мають у своєму розпорядженні дуже невелика кількість тест-систем, що дозволяють проводити кількісну оцінку виявлених антитіл, - для цього набір реагентів повинен мати у своєму складі спеціальні атестовані калібратори і контролі, атестацію яких бажано проводити відносно міжнародних стандартів ВООЗ.
Однак, незважаючи на перераховані недоліки, все ж не має сенсу скидати з рахунків такий клініко-лабораторний метод, як ІФА, тим більше що в рамках реалізації національного проекту “Здоров'я” лабораторії ЛПЗ первинної ланки практично повсюдного були оснащені відповідним обладнанням.
У ІФА є і свої переваги перед прямими методами діагностики, а саме:
~ можливість використання для масового скринінгу;
~ відносна простота методики;
~ доступність біологічного матеріалу - сироватки крові;
~ низька собівартість аналізу;~ можливість автоматизації і стандартизації процедури аналізу;
~ відкритість методу - можливість використовувати будь-тест-системи.
У зв'язку з вищевикладеним спробуємо трохи інакше, по-новому поглянути на застосування технології ІФА діагностики урогенітальних інфекцій.
В залежності від клінічних завдань, які будуть поставлені перед лабораторією, можливі три рівні застосування ІФА в діагностиці інфекцій, що передаються статевим шляхом (ІПСШ).
Якісний варіант аналізу необхідний при масовому скринінгу населення і для типування вірусоносійства. В даному випадку лабораторії достатньо визначати тільки IgG-антитіла, причому визначати титр антитіл не потрібно.
Кількісний варіант аналізу застосовується для динамічного спостереження в процесі терапії за допомогою дослідження парних сироваток. Даний варіант припускає аналіз антитіл різних класів. Результат видається лабораторією в титрах (в МО/мл або в РЕ/мл). Звичайно, в цьому випадку будуть потрібні кількісні тест-системи, що містять відповідні калібратори і контролі. Додатково слід мати на увазі, що разове визначення титру антитіл діагностичної значимості не має і, якщо пацієнт не може бути обстежений повторно, немає сенсу використовувати дорогу кількісну тест-систему.
Для урогенітальних інфекцій не існує поняття протективного титру антитіл. Одна з особливостей ІПСШ полягає в тому, що пацієнт приходить до лікаря-клініцисту, а потім в лабораторію, коли термін інфікування визначити важко, клінічна симптоматика присутній у “стертій” формі, можливі наявність мікст-інфекції, застосування антибіотикотерапії в анамнезі з ряду причин, не пов'язаних з поточним станом пацієнта. Всі ці фактори в тому чи іншому поєднанні, призводять до того, що титр антитіл на момент одноразового обстеження (будь-якого класу антитіл) у кожного пацієнта абсолютно індивідуальний.
І, нарешті, найбільш цікавий і перспективний рівень застосування технології ІФА діагностики урогенітальних інфекцій - визначення антитіл до особливим, клінічно значущим білків.
Розглянемо три запропонованих рівня застосування ІФА на прикладі діагностики герпесвірусної і хламідійної інфекцій.
На сьогоднішній день відомо вісім вірусів герпесу, контагиозных для людини (табл.). Віруси герпесу людини (ВГЧ) пронумеровані ВООЗ і поділені на підродини.
Інфікованість популяції кожним з видів ВГЧ різна. Максимальне поширення серед населення (за частотою виявлення) мають:
ВПГ-1, ЦМВ, ВВО, ВЕБ і ВПГ-2. Герпесвірусна інфекція (ГВІ) є опортуністичною і супроводжується довічної латенцией. Таким чином, кожен індивідуум у популяції може бути носієм деякої “колекції” герпесвірусів. Тому перший рівень застосування ІФА, у контексті вивчення ДЗІ, у вигляді визначення IgG-антитіл (якісно) до антигенів того чи іншого вірусу вирішує питання типування вірусоносійства, визначення герпетичної навантаження у конкретного пацієнта, що можливо здійснити в умовах масового скринінгу.
Другий рівень - оцінка концентрації IgG-антитіл у парних сироватках, отриманих від пацієнта при динамічному спостереженні в процесі підтвердження діагнозу або терапії. Можливо визначення антитіл класу IgM - як маркерів гострої інфекції.
Третій рівень - визначення різних класів антитіл до клінічно значущим білків того чи іншого ВГЧ.
Білки вірусів герпесу прийнято класифікувати на структурні та неструктурні. До перших відносять білки, які становлять капсид і є в складі липопротеидной оболонки вірусу. Неструктурні білки кодуються геномом віріона, з'являються при його активації і обумовлюють процес внутрішньоклітинної репродукції вірусу на різних його етапах. Тобто це особливі регуляторні білки і ферменти, яких у складі “готової” вірусної частинки немає. Кожен з цих типів білків з часу синтезу в ході інфікування клітини умовно ділять на дуже ранні (або предранние), ранні і пізні. Надранні та ранні неструктурні білки утворюються в ураженій клітині початкових стадіях вірусної реплікації ще до початку синтезу вірусної ДНК. Ці білки можуть экспрессироваться на поверхні клітини-мішені, оцінюватися імунною системою пацієнта як чужорідні антигени і тим самим викликати синтез антитіл. Потім вірус синтезує ранні і пізні структурні білки. Характерною рисою ВГЧ є каскадний характер синтезу вірусних білків. Це означає, що білки синтезуються послідовно, причому раніше синтезовані молекули регулюють синтез наступних.
Дане відступ дозволяє зрозуміти, що вивчити активність ДЗІ, її стадію можна за оцінкою різних класів антитіл до перерахованих неструктурным і структурних білків. Виявлення зазначених антитіл дозволяє судити про активну реплікацію вірусу і загостренні ДЗІ.
Подібний підхід успішно застосовується поки що тільки при діагностиці трьох видів герпесу - ВЕБ, ВВО і ЦМВ. Серологічний профіль ВЕБ-інфекції аналізують з використанням тест-систем для оцінки різних класів антитіл до VCA, ЕА і NA-1 білків ВЕБ, ЦМВ-інфекції - по антитілам до IE і рр150 білків ЦМВ; ВВО-інфекції - по антитілам до глікопротеїну Е ПВО.
ІФА тест-системи, що застосовуються на третьому рівні діагностики, випускаються як зарубіжними, так і вітчизняними виробниками. Їх використання дозволяє в деяких випадках, з точністю до тижня дати відповідь або про момент інфікування ВГЧ, або рецидив ГВІ.
З цих же позицій можна розглянути хламідійну інфекцію. Попередньо зупинимося на антигенному складі хламідійної клітини. Відомо, що найбільш иммуногенны три білка Ch.trachomatis - MOMP, HSP60 і білок, який кодується плазміди, - pgp3. Саме на ці білки імунна система людини найбільш інтенсивно відповідає продукцією антитіл. MOMP - білок зовнішньої мембрани хламідійної клітини - становить близько 60% всіх білків оболонки. MOMP є основним (головним) антигеном Ch.Тrachomatis і першим розпізнається нашою імунною системою. IgM-антитіла до MOMP утворюються приблизно через 10 днів після первинного інфікування.
Pgp3 - внутрішній, мембранассоциированный білок, який кодується плазміди, який синтезується в процесі життєвого циклу хламідій. Він розпізнається нашою імунною системою пізніше, після багаторазового повторення життєвого циклу хламідій. Антитіла до pgp3 з'являються слідом за антитілами до MOMP, і їх виявлення вказує на те, що хламідії не тільки проникли в організм, але і почали активно розмножуватися. Антитіла до pgp3 є маркерами хронізації процесу. Введення тесту на визначення pgp3 в імуноферментну тест-систему істотно підвищує її специфічність. Як показує клінічна практика застосування таких наборів, приблизно у 20% пацієнтів з хронічною хламідійною інфекцією IgG до МОМР можуть не визначатися (істотно знижується титр), в той час як IgG до pgp3+МОМР все ще виявляються. Пацієнти з таким серологічним відповіддю, звичайно, вимагають додаткового спостереження та корекції терапії.
І третій за значимістю білок Ch.trachomatis - це HSP60, білок теплового шоку. Білки теплового шоку - шапероны - давно відомі біологам. Синтез шаперонов характерний для клітин усіх типів живих організмів - бактерій, грибів, рослин. HSP60 синтезуються клітинами у відповідь на дію стресових факторів навколишнього середовища. Ці білки допомагають клітині вижити в умовах стресу і повернутися до нормального життя після припинення впливу агресивних факторів.
У хламідій HSP60 з'являється тільки у L-форми, та виявлення антитіл до нього вкаже нам на L-трансформацію. L-трансформація - природна пристосувальна реакція хламідійної клітини у відповідь на негативний вплив з боку організму хазяїна, яка виражається в порушенні життєвого циклу хламідій.
L-трансформація характерна для персистентних і латентних форм хламідіозу. З морфологічної точки зору такий захисний механізм реалізується шляхом різкого зниження синтезу основних білків клітинної стінки хламідій - МОМР і ОМР. Синтез ж білка теплового шоку HSP60, навпаки, різко зростає, що підсилює ригідність клітинної стінки, що надає їй особливу жорсткість. Такі суттєві зміни в структурі мембрани мікроорганізму призводять до того, що L-форми не ростуть на використовуваних для виділення хламідій клітинних культурах.
На першому рівні ІФА-діагностики хламідіозу в основному застосовуються тест-системи для виявлення антитіл класу IgG (МОМР), що проводиться в умовах масового скринінгу. Але можливе й використання тест-систем для оцінки всіх трьох класів імуноглобулінів - IgG, IgA, IgM (МОМР), причому IgA і IgM-антитіла будуть маркерами ранньої (гострої) інфекції. Слід згадати, що виявлення антитіл первинного інфікування при хламідіозі - відносно рідкісне явище, але це пов'язано не з якістю використовуваних тест-систем, а з термінами звернення пацієнтів за допомогою.
В рамках динамічного спостереження (другий етап ІФА-діагностики) застосовують аналогічні тест-системи. Досліджуються парні сироватки, відповідь видається лабораторією в титрах. Антитілами, найбільш швидко реагують на терапію, вважаються IgA-антитіла до МОМР. Саме цей клас антитіл має сенс оцінювати в процесі лікування пацієнтів, якщо, звичайно, вони були виявлені при первинному обстеженні.
Третій рівень застосування ІФА потрібен і затребуваний при підозрі на наявність різних форм важкої хронічної хламідійної інфекції. На цьому етапі застосовують тест-системи для виявлення анти-Pgp3-IgG-антитіл анти - HSP60-IgG-антитіл, які є маркерами хронізації хламідіозу і L-трансформації хламідійної клітини. Дійсно, при тяжкій, затяжний інфекції часті знахідки IgG до Pgp3, при негативній відповіді на двох попередніх етапах діагностики. У свою чергу, антитіла проти HSP60 на сьогоднішній день є єдиними маркерами порушення життєвого циклу хламідійної клітини, маркерами латентної форми інфекції.
Ми розглянули три рівня застосування ІФА в діагностиці двох інфекцій. Будемо сподіватися, що прогресивний розвиток молекулярно-біологічних технологій в найближчому майбутньому відкриє перед фахівцям закладу кдл нові перспективи застосування цього клініко-лабораторного методу.
Список використаної літератури
1. Герпес - невідома епідемія. Укладач Абазова Ф.І. Смоленськ, 1997.
2. Таранов А.Г. Лабораторна діагностика в акушерстві та гінекології. Довідник. М., 2004.
3. Баткаев Е.О., Липова Є.В. Урогенітальний хламідіоз. Посібник для лікарів. М., 2004.
4. Європейські стандарти дианостики і лікування захворювань, що передаються статевим шляхом. М., 2004.
5. Лобзин Ю.В. і співавт. Хламідійні інфекції. СПб., 2003.
 

Дата: 08.09.2013